Ретикулоцити норма і підрахунок їх кількості. Підрахунок ретикулоцитів (в крові) Для визначення кількості ретикулоцитів рекомендується методика забарвлення

Це пов'язано з тим, що метод простий, досить дешевий і не вимагає спеціального дорогого обладнання, в зв'язку з чим може застосовуватися в будь-який клініко-діагностичної лабораторії.

принцип методу

Виявлення зернисто-сітчастої субстанції ретикулоцитів при суправітально забарвленні лужними фарбами з подальшим підрахунком їх в мазку крові.

реактиви

Можна використовувати один з наступних барвників:

Насичений розчин діамантового крезілового синього в абсолютному спирті (для приготування абсолютного спирту треба витримати 96% етанол в декількох змінах прокаленного порошку мідного купоросу). На 100 мл абсолютного спирту беруть 1,2 г фарби.
Розчин Азура I: АЗУР I - 1 г, амонію оксалат - 0,4 г, натрію хлорид - 0,8 г, спирт етиловий 96% - 10 мл, дистильована вода - 90 мл. Розчин фарби в закритому флаконі поміщають на 2 - 3 дні в термостат при 37 ° C і періодично енергійно збовтують. Потім охолоджують до кімнатної температури і фільтрують через паперовий фільтр. Розчин зберігають в посуді з темного скла. При появі осаду фарбу слід знову профільтрувати.
Розчин Азура II: АЗУР II - 1 г, натрію цитрат - 5 г, натрію хлорид - 0,4 г, дистильована вода - 45 мл. Розчин залишають в термостат при 37 ° C на 2 доби, періодично помішуючи. Для прискорення розчинення фарбу можна прогріти на слабкому вогні протягом 15 - 20 хв, не доводячи до кипіння. Охолоджують до кімнатної температури і фільтрують. Зберігають в посуді з темного скла.

Спеціальне обладнання

хід визначення

Забарвлення ретикулоцитів проводять або на склі, або в пробірці.

Забарвлення ретикулоцитів на склі

При фарбуванні ретикулоцитів на склі добре вимите і знежирене предметне скло підігрівають над полум'ям пальника. Скляною паличкою наносять на скло краплю одного з перерахованих вище барвників і готують мазок з фарби шліфованим склом. Склографом маркують сторону скла, на яку нанесений мазок фарби. У такому вигляді скла можна заготовити про запас і зберігати в сухому темному місці. Перед проведенням аналізу готують вологу камеру. Зазвичай для цього користуються чашкою Петрі з укладеними по краях валиками змоченою вати або фільтрувального паперу. Наносять краплю крові на мазок фарби, готують з неї тонкий мазок і негайно поміщають у вологу камеру на 3 - 10 хв. Потім висушують мазки на повітрі.

Забарвлення ретикулоцитів в пробірці

Забарвлення ретикулоцитів в пробірці відрізняється при використанні різних барвників.

Метод 1 - забарвлення ретикулоцитів в пробірці діамантовим крезіловим синім.

Перед вживанням готують в пробірці робочий розчин діамантового крезілового синього з розрахунку на краплю 1% розчину оксалату калію 4 краплі розчину фарби діамантового крезілового синього. У фарбу додають 0,04 мл крові (дві піпетки до позначки 0,02). Суміш ретельно, але обережно перемішують і залишають на 30 хвилин. Потім знову перемішують і готують тонкі мазки.

Метод 2 - забарвлення ретикулоцитів в пробірці азуром II.

Метод 3 - забарвлення ретикулоцитів в пробірці азуром I.

В даний час у продажу є готові барвники для ретикулоцитів заводського виготовлення. Забарвлення ретикулоцитів з їх допомогою проводиться згідно з відповідною інструкцією.

Підрахунок ретикулоцитів.

Приготовлені одним із зазначених вище способів мазки микроскопируют з іммерсійним об'єктивом. В мазку ретикулоцити і еритроцити пофарбовані в жовтувато-зеленуватий колір, зернисто-нитчатая субстанція в ретикулоцитах - в синій (при фарбуванні азуром II і діамантовим крезіловим синім) або синювато-фіолетовий колір (при фарбуванні азуром I).

Фотографії ретикулоцитів:

Знаходять поля зору, де еритроцити розташовуються окремо. У цих полях зору необхідно підрахувати щонайменше 1000 еритроцитів і відзначити серед них кількість еритроцитів, що містять зернисто-нитчатую субстанцію. Велика точність виходить при підрахунку на 2000 - 3000 еритроцитів.

У зв'язку з тим, що в поле зору розташовується велика кількість еритроцитів, що ускладнює підрахунок, необхідно обмежити (зменшити) поле зору. Для цього можна скористатися або спеціальним окуляром, в якому можна зменшити поле зору до необхідних розмірів, або скористатися спеціальним «віконцем» (з паперу вирізують коло діаметром трохи менше окуляра, в центрі кола вирізують невеликий ромб і вставляють отримане віконце в окуляр).

Кількість підрахованих ретикулоцитів виражають на 100 (у відсотках) або на 1000 (в проміле) еритроцитів.

приклад: При підрахунку в мазку 1000 еритроцитів виявлено, що 15 еритроцитів з 1000 мають зернисто-сітчасту субстанцію тій чи іншій мірі, тобто є ретикулоцити. Отже, кількість ретикулоцитів в даному випадку становить 1,5% або 15 ‰.

література:

Довідник «Лабораторні методи дослідження в клініці» під редакцією Меньшикова В. В. - Москва, «Медицина», 1987 р
Любина А. Я., Іллічова Л. П. та співавтори - «Клінічні лабораторні дослідження» - Москва, «Медицина», 1984 р

Підрахунок кількості ретикулоцитів за допомогою люмінесцентної мікроскопії

Метод підрахунку кількості ретикулоцитів за допомогою люмінесцентної мікроскопії відрізняється простотою і вимагає трохи часу, більш точний в порівнянні зі звичайним методом, так як при люмінесцентної мікроскопії виявляються дрібні зерна сетчато-нитчастих речовини.

ретикулоцити

Ретикулоцити - молоді еритроцити, що утворюються після втрати нормобластов ядер. Характерною особливістю ретикулоцитів є наявність в їх цитоплазмі зернисто-нитчатой \u200b\u200bсубстанції (ретикулума), що представляє агреговані рибосоми і мітохондрії.

Патологічні включення в еритроцитах

Тельця Жолли (тільця Хауелла-Жолли) - дрібні круглі фіолетово-червоні включення размероммкм, зустрічаються по 1 (рідше по 2 - 3) в одному еритроциті. Предсталяют собою залишок ядра після видалення його РЕМ. Виявляються при інтенсивному гемолізі і "прегрузке" РЕМ, після спленектомії, при мегалобластноїанемії ..

Цитохимические дослідження ліпідів

Цитохимические дослідження ліпідів засноване на застосуванні барвників, що розчиняються в жирах (судан III, судан IV, чорний судан і ін.). Для виявлення нейтрального жиру користуються Суданом III, забарвлює жир в помаранчевий колір. Ліпоїдами виявляються краще Суданом чорним (чорне забарвлення).

Аналіз сечі по Нечипоренко

Метод Нечипоренко у вітчизняній лабораторній діагностиці є найбільш поширеним методом кількісного визначення формених елементів в сечі. Цей метод найбільш простий, доступний будь-якій лабораторії і зручний в амбулаторній практиці, а також має ряд переваг перед іншими відомими кількісними методами дослідження осаду сечі. За методом Нечипоренко визначають кількість формених елементів (еритроцитів, лейкоцитів і циліндрів) в 1 мл сечі.

Методи забарвлення ретикулоцитів

Принцип. Суправітально забарвлення барвниками, які виявляють зернисто-сітчасту субстанцію ретикулоцитів.

Реактиви. Можна використовувати один з наступних барвників: 1) насичений розчин діамантового крезілового синього в абсолютному етиловому спирті. Для приготування абсолютного спирту треба витримати 96% етанол в декількох змінах прокаленного порошку мідного купоросу. На 100 мл абсолютного спирту беруть 1,2 г фарби; 2) розчин Азура 1 по П. Н. Корикову: АЗУР I - 1 г; амонію оксалат - 0,4 г; натрію хлорид - 0,8 г; 96% етиловий спирт-10мл; дистильована вода - 90 мл. Розчин фарби в закритому флаконі поміщають на 2-3 дня в термостат при 37 ° С і періодично енергійно збовтують. Потім охолоджують до кімнатної температури і фільтрують через паперовий фільтр. Розчин зберігають в посуді з темного скла. При появі осаду фарбу слід знову профільтрувати; 3) розчин Азура II: АЗУР II - 1 г; натрію цитрат - 5 г; натрію хлорид - 0,4 г; дистильована вода - 45 мл. Розчин залишають в термостаті при 37 ° С на 2 доби, періодично помішуючи. Для прискорення розчинення фарбу можна прогріти на слабкому вогні протягом 15-20 хв, не доводячи до кипіння. Охолоджують до кімнатної температури і фільтрують. Зберігають в посуді з темного скла.

Хід визначення. Забарвлення на склі. Добре вимите і знежирене предметне скло підігрівають над полум'ям пальника.

Скляною паличкою наносять на скло краплю одного з барвників і готують мазок з фарби шліфованим склом. Маркують сторону скла, на яку нанесений мазок фарби, склографом. У такому вигляді скла можна заготовити про запас і зберігати в сухому темному місці. Наносять краплю крові на мазок фарби, готують з неї топкий мазок і негайно поміщають у вологу камеру на 3-4 хв (можна користуватися чашкою Петрі з укладеними по краях валиками змоченою вати, марлі або фільтрувального паперу). Потім висушують мазки на повітрі.

У приготованих таким чином мазках еритроцити пофарбовані в жовтувато-зеленуватий колір, зернисто-сітчаста субстанція - в синій колір.

Забарвлення в пробірці. Методика 1: перед вживанням готують в пробірці робочий розчин діамантового крезілового синього з розрахунку на 1 краплю 1% розчину оксалату калію 4 краплі розчину фарби (реактив 1). У фарбу додають 0,04 мл крові (дві піпетки до позначки 0,02). Суміш ретельно, але обережно перемішують і залишають на 30 хв. Перемішують і готують тонкі мазки.

Методика 2: в пробірку поміщають 0,05 мл розчину фарби 3 і 0,2 мл крові. Суміш ретельно перемішують і залишають на 20-30 хв. Перемішують і готують тонкі мазки.

Методика 3: в пробірку вносять 0,3-0,5 мл розчину фарби 2 і 5-6 крапель крові піпеткою від апарату Панченкова. Пробірку закривають гумовою пробкою, суміш ретельно, але обережно перемішують і залишають на 1-1,5 год (краще фарбуються ретикулоцити при експозиції 1,5-3 ч). Перемішують і готують тонкі мазки.

Підрахунок ретикулоцитів. В мазках еритроцити пофарбовані в жовтувато-зеленуватий колір, зернисто-сітчаста субстанція - в синій або сіневатофіолетовий колір.

Приготовлені одним із зазначених вище способів мазки микроскопируют з іммерсійним об'єктивом. Необхідно підрахувати щонайменше 1000 еритроцитів (велика точність виходить при підрахунку 2000-3000 еритроцитів) і відзначити серед них кількість клітин, що містять зернисто-сітчасту субстанцію. На практиці для більшої точності користуються спеціальним окуляром, в якому можна зменшити поле зору до необхідних розмірів. При рівномірних тонких мазках, в яких еритроцити розташовані в один ряд, підбирають таке поле зору, в якому є, наприклад, 50 еритроцитів, і потім прораховують 20 таких полів зору.

При відсутності готового окуляра його можна легко приготувати, для чого відгвинчують окуляр 7 ×, вкладають в нього шматок паперу з вирізаним невеликим квадратиком і загвинчують. Кількість підрахованих ретикулоцитів виражають на 1000 або на 100 еритроцитів.

Техніка забору крові на ретикулоцити і техніка підрахунку кількості ретикулоцитів.

Підрахунок ретикулоцитів в мазку після забарвлення їх спеціальними барвниками

Принцип методу: Виявлення зернисто-сітчастої субстанції ретикулоцитів при суправітально забарвленні лужними фарбами з подальшим підрахунком їх в мазку крові.

Можна використовувати один з наступних барвників: Розчин Азура I; Розчин Азура II;

Хід визначення: Забарвлення проводять або на склі, або в пробірці.

Забарвлення ретикулоцитів в пробірці азуром II

У пробірку поміщають 0,05 мл розчину фарби АЗУР II і 0,2 мл крові. Суміш ретельно перемішують і залишають на 20 - 30 хвилин. Знову перемішують і готують тонкі мазки.

Забарвлення ретикулоцитів в пробірці азуром I

У пробірку поміщають 0,3 - 0,5 мл розчину фарби АЗУР I і 5 - 6 крапель крові піпеткою від апарату Панченкова. Пробірку закривають гумовою пробкою, суміш ретельно, але обережно перемішують і залишають на 1 - 1,5 години (ретикулоцити фарбуються краще при експозиції 1,5 - 3 години). Перемішують і готують тонкі мазки.

Приготовлені мазки микроскопируют з іммерсійним об'єктивом. В мазку ретикулоцити і еритроцити пофарбовані в жовтувато-зеленуватий колір, зернисто-нитчатая субстанція в ретикулоцитах - в синій (при фарбуванні азуром II) або синювато-фіолетовий колір (при фарбуванні азуром I).

Ретикулоцити є важливим показником регенераторной здатності кісткового мозку. Збільшення їх в периферичної крові (ретикулоцитоз) відзначається при гемолітичних анеміях, При гемолітичних кризах, при гострих крововтратах, малярії, при лікуванні залізом залізодефіцитних анемій, При гострій нестачі кисню. Наявність підвищеної кількості ретикулоцитів дозволяє запідозрити приховане кровотеча (наприклад, у хворих на черевний тиф, виразкову хворобу).

Зниження кількості або відсутність ретикулоцитів (ретикулоцитопенія) спостерігається при арегенераторних апластических і гипопластических анеміях; анеміях, викликаних недостатністю вмісту заліза, вітаміну B12, фолієвої кислоти; при метастазах раку в кістку; променевої хвороби; променевої терапії; лікуванні цитостатиками.

Техніка проведення проби Рівальта.

Проба Рівальта - біохімічний тест для диференціюванні транссудата і ексудату.

Методика полягає в наступному: ексудату містять серомуцін (з'єднання глобулиновой природи), що дає позитивну пробу (денатурацію) зі слабким розчином оцтової кислоти. У циліндр наливають 100-150 мл дистильованої води, підкисляють 2-3 краплями крижаної оцтової кислоти і додають по краплях досліджувану рідину. Падаюча крапля ексудату утворює помутніння у вигляді білого хмарки, що опускається до дна посудини. Крапля транссудата не утворює помутніння, або воно буває незначним і швидко розчиняється. Незважаючи на зазначені відмінності ексудатів і транссудату, розмежувати їх на практиці не завжди легко, так як іноді доводиться мати справу з низкою перехідних рідин, а також ексудату, які за вмістом білка і відносної щільності стоять близько до транссудату.

Методи підрахунку кількості ретикулоцитів

1. Підрахунок кількості ретикулоцитів в мазку після забарвлення їх спеціальними барвниками.

даний метод є на практиці найбільш використовуваним методом в зв'язку з тим, що він простий, досить дешевий і не вимагає спеціального дорогого устаткування, відповідно може застосовуватися в будь-який клініко-діагностичної лабораторії.

Підрахунок здійснюють за допомогою мікроскопа: приготовані одним із зазначених вище способів мазки микроскопируют з іммерсійним об'єктивом; в мазку ретикулоцити і еритроцити пофарбовані в жовтувато-зеленуватий колір, зернисто-нитчатая субстанція в ретикулоцитах - в синій (при фарбуванні азуром II і діамантовим крезіловим синім) або синювато-фіолетовий колір (при фарбуванні азуром I).

2. Підрахунок кількості ретикулоцитів за допомогою люминисцентной мікроскопії.

Даний метод відрізняється простотою і вимагає трохи часу, більш точний в порівнянні зі звичайним методом, так як при люминисцентной мікроскопії виявляються дрібні зерна сетчато-нитчастих речовини, проте він можливий тільки при наявності люминисцентного мікроскопа і спеціальних барвників, у зв'язку з чим доступний лише небагатьом лабораторіям.

Принцип підрахунку кількості ретикулоцитів за допомогою люминисцентной мікроскопії заснований на використанні здатності субстанції ретикулоцитів флюоресцировать після обробки крові акридиновим помаранчевим. Кров змішують з акридиновим помаранчевим в пробірці або змішувачі в співвідношенні 1 частина крові і 10 частин фарби. Суміш перемішують протягом 2 хвилин, краплю суміші наносять на предметне скло і накривають покривним склом. При цьому рідина не повинна виходити за межі покривного скла.

Мікроскопують за допомогою світлофільтру ЖС-17. У препараті еритроцити мають темно-зелені обриси і не флюоресцируют, а в ретикулоцитах зернисто-сітчаста субстанція світиться яскраво-червоним кольором, завдяки чому ретикулоцити легко підрахувати. У крові, стабілізованої гепарином або цитратом натрію, флюоресценції ретикулоцитів не спостерігається.

3. Автоматичний підрахунок кількості ретикулоцитів за допомогою гематологічного аналізатора.

В сучасних гематологічних аналізаторах технологія підрахунку формених елементів крові заснована на кондуктометричну методі, запропонованому H.Wallace і Joseph R. Culter в 1947 році. Принцип методу полягає в підрахунку числа і визначенні характеру імпульсів, що виникають при проходженні клітини через отвір малого діаметру (апертуру), по обидва боки якого розташовані два ізольованих один від одного електрода. Кожне проходження клітини через апертуру супроводжується появою електричного імпульсу, який реєструється електронним датчиком. Поділ клітин за категоріями (еритроцити, лейкоцити, тромбоцити, осад) здійснюється приладом на підставі аналізу амплітуди отриманих імпульсів. Щоб визначити концентрацію клітин, досить пропустити певний обсяг проби через канал і підрахувати кількість імпульсів, що при цьому генеруються.

Слід звернути увагу на те, що крім класичного параметра ретикулоцитів - відносне (процентне) вміст ретикулоцитів (RET%, percent of reticulocytes), яке визначається за допомогою 1 і 2 методів лабораторної діагностики, в зв'язку з появою високотехнологічних гематологічних аналізаторів (3 метод), стало можливим отримувати (наприклад, за допомогою запатентованого флюоресцентного барвника для аналізатора Sysmex-XT-200i) додаткові інфарматівине ретикулоцитарного параметри:

1. Ретикулоцити з низьким вмістом РНК, найбільш зрілі (LFR%, low fluorescence reticulocyte fractions, фракція ретикулоцитів з низькою флуоресценцией).

2. Ретикулоцити із середнім вмістом РНК (MFR%, medium fluorescence reticulocyte fractions, фракція ретикулоцитів із середньою флуоресценцией).

3. Ретикулоцити з високим вмістом РНК (HFR%, high fluorescence reticulocyte fractions, фракція ретикулоцитів з високою флуоресценцией).

4. Незрілі фракція ретикулоцитів (IFR%, Immature Reticulocyte Fraction).

Диференціація ретикулоцитів, заснована на ступені зрілості і, відповідно, зміст нуклеїнових кислот, є відображенням гемопоетичних активності кісткового мозку.

Методика (аналізатор Sysmex-XT-2000i). У проточній кюветі клітини перетинають промінь напівпровідникового лазера, при цьому відбувається розсіювання променя під великим і малим кутами і збудження флюорсцентного барвника. Це дозволяє визначати різні стадії зрілості ретикулоцитів за змістом РНК в клітинах і інтенсивності їх світіння. Автоматизований підрахунок ретикулоцитів відрізняється високою точністю (підраховується болееерітроцітов) і відтворюваністю (коефіцієнт варіації становить близько 6%). Дана технологія забезпечує точний підрахунок ретикулоцитів навіть при їх гранично низьких концентраціях.

ретикулоцити

Ретікулоінти - молоді еритроцити, що утворюються після втрати нормобластов ядер. Характерною особливістю ретикулоцитів є наявність в цитоплазмі зернисто-нитчатой \u200b\u200bсубстанції, що представляє агреговані рибосоми і мітохондрії. Ця субстанція виявляється при спеціальному методі забарвлення - суправітально, т. Е. Без попередньої фіксації клітин. Зернисто-нитчатая субстанція в різних ретикулоцитах відрізняється поліморфізмом: чим клітина молодше, тим субстанція більш рясна. У наймолодших ретикулоцитів вона має форму густого клубка, у більш зрілих клітин виявляється у вигляді сіточки, окремих ниток і потім окремих зерен. У мазках, пофарбованих звичайними гематологічними методами, ретикулоцити сірувато-рожевого кольору - поліхроматофільний, т. Е. Пофарбовані різними барвниками.

Визначення кількості ретикулоцитів проводиться при мікроскопії спеціально забарвлених мазків.

Уніфікований метод підрахунку кількості ретикулоцитів після забарвлення їх діамантовим крезіловим синім, азуром I або азуром II безпосередньо на склі або в пробірці (1972).

Суправітально забарвлення барвниками, які виявляють зернисто-нитчатую субстанцію ретикулоцитів.

1.Насищенний розчин діамантового крезілового синього в абсолютному спирті (для приготування абсолютного спирту треба витримати етанол 96% в декількох змінах прокаленного порошку мідного купоросу). На 100 мл абсолютного спирту беруть 1,2 г фарби.

2.Раствор Азура I, запропонований П. Н. Корікова: АЗУР 1 - 1 г, амонію оксалат - 0,4 г, натрію хлорид- 0.8 г, спирт етиловий 96% 10 мл, дистильована вода - 90 мл. Розчин фарби в закритому флаконі поміщають на 2-3 дня в термостат при 37 ° С і періодично енергійно збовтують. Потім охолоджують до кімнатної температури і фільтрують через паперовий фільтр. Розчин зберігають в посуді з темного скла. При появі осаду фарбу слід знову профільтрувати.

3.Раствор Азура II наступного складу: АЗУР II 1 г, натрію цитрат 5 г, натрію хлорид, 0,4 г, дистильована вода 45 мл. Розчин залишають в термостаті при 37 ° С на 2 діб, періодично помішуючи. Для прискорення розчинення фарбу можна прогріти на слабкому вогні в теченіемін, не доводячи до кипіння. Охолоджують до кімнатної температури і фільтрую). Зберігають в посуді з темного скла.

Добре вимите і знежирене предметне скло підігрівають над полум'ям пальника. Скляною паличкою наносять на скло краплю одного з барвників і готують мазок з фарби шліфованим склом. Маркують сторону скла, на яку нанесений мазок фарби, склографом. У такому вигляді скла можна заготовити про запас і зберігати в сухому темному місці. Наносять краплю крові на мазок фарби, готують з неї тонкий мазок і негайно поміщають у вологу камеру на 3-4 хв (можна користуватися чашкою Петрі з укладеними по краях валиками змоченою вати або фільтрувального паперу). Потім висушують мазки на повітрі.

У приготованих таким чином мазках еритроцити пофарбовані в жовтувато-зеленуватий колір, зернисто-нитчатая субстанція - в синій колір.

Метод 1: перед вживанням готують в пробірці робочий розчин діамантового крезілового синього з розрахунку на краплю 1% розчину оксалату калію 4 краплі розчину фарби 1. У фарбу додають 0,04 мл крові (дві піпетки до позначки 0,02). Суміш ретельно, але обережно перемішують і залишають на 30 хв. Перемішують і готують тонкі мазки.

Метод 2: в пробірку поміщають 0,05 мл розчину фарби 3 і 0,2 мл крові. Суміш ретельно перемішують і залишають Намин. Перемішують і готують тонкі мазки.

Метод 3: в пробірку поміщають 0,3-0,5 мл розчину фарби 2 і 5-6 крапель крові піпеткою від апарату Панченкова. Пробірку накривають гумовою пробкою, суміш ретельно, але обережно перемішують і залишають на 1-2 години (краще фарбуються ретикулоцити при експозиції 2-3 год). Перемішують і готують тонкі мазки.

В мазках еритроцити пофарбовані в жовтувато-зеленуватий колір, зернисто-нитчатая субстанція в синій або синювато-фіолетовий колір.

Приготовлені одним із зазначених вище способів мазки микроскопируют з іммерсійним об'єктивом. Необхідно підрахувати щонайменше 1000 еритроцитів і відзначити серед них кількість еритроцитів, що містять зернисто-нитчатую субстанцію. Практично для більшої точності користуються спеціальним окуляром, в якому можна зменшити поле зору до необхідних розмірів. При рівномірних тонких мазках, в яких еритроцити розташовані в один ряд, підбирають таке поле зору, в якому є, наприклад, 50 еритроцитів, і потім прораховують 20 таких полів зору.

При відсутності готового окуляра його можна легко приготувати, для чого відгвинчують окуляр 10Х, вкладають в нього шматок паперу з вирізаним невеликим квадратиком і загвинчують.

Кількість підрахованих ретикулоцитів виражають на 1000 або на 100 еритроцитів.

Підрахунок кількості ретикулоцитів за допомогою люмінесцентної мікроскопії.

Використання здатності субстанції ретикулоцитів флюоресцировать після обробки крові акридиновим помаранчевим.

1. Розчин акридинового оранжевого на фізіологічному розчині хлориду натрію і концентрації 1: 5000. Для приготування ізотонічного розчину рекомендують використовувати дистильовану воду pH 5,8-6,8, Розчин акридинового оранжевого повинен бути свіжим; зберігають його не більше 3-5 днів в темному флаконі з притертою пробкою.

2. Нефлюоресцірующее іммерсійне масло.

Можна використовувати афлуоль або звичайне іммерсійне масло з флюоресценцией, погашеної нітробензолом (0,3 мл нітробензолу на 1 мл олії). Ю. Н. Зубжицький як нефлюореспірующего масла пропонує використовувати перегнаний анізол.

Спеціальне обладнання. Мікроскоп ультрафіолетовий МУФ-ЗМ або люмінесцентний.

Кров змішують з акридиновим помаранчевим в пробірці або змішувачі в співвідношенні 1 частина крові і 10 частин фарби (суміш можна зберігати не більше 5 год). Суміш перемішують протягом 2 хв, краплю суміші наносять на предметне скло і накривають покривним склом.

Мікроскопують за допомогою світлофільтру ЖС-17.

У препараті еритроцити не флуоресціює, а в ретикулоцитах зернисто-нитчатая субстанція світиться яскраво-червоним кольором.

Помічено, що в крові, стабілізованої гепарином або цитратом натрію, флюоресценції ретикулоцитів не спостерігається.

Метод відрізняється простотою і вимагає трохи часу; завдяки яскравого світіння ретикулоцити легко підрахувати.

Нормальні величини. У здорових число ретикулоцитів составляетпроміле, або 0,2-1,2%.

Число ретикулоцитів в крові відображає регенеративні властивості кісткового мозку, і оцінка його широко використовується при різних анеміях (див. Табл. 24). Підвищення кількості ретпкулоцітов спостерігається після крововтрати, при гемолітичних анеміях, особливо в період кризи (кількість ретикулоцитів може бути%), а також на тлі лікування анемії Аддісона Бірмера вітаміном В12 (ретікулоцітарний криз - підйом числаретикулоцитів на 4-8-й день лікування). Зниження кількості ретикулоцитів характерно для гіпопластична анемія, рецидиву анемії Аддісона-Бірмера

Визначення кількості ретикулоцитів може бути використано для визначення продукції еритропоезу і обчислення строку життя еритроцитів.

Література. Гомзякова Н. В. Лаб, справа, 1960, № 5, с. 38-39;

Зубжицький Ю. Н. Лаб. справа; 1967 № 2, с. 35;

Ретикулоцити (reticulocytus)

Морфологія і функції ретикулоцитів. Методи підрахунку ретикулоцитів. Кількісний вміст ретикулоцитів.

Морфологія і функції ретикулоцитів

Ретикулоцити - це молоді еритроцити, що утворюються після втрати нормобластов ядер.

Характерною особливістю ретикулоцитів є наявність зернисто-сітчастої субстанції, яка проявляється при суправітально забарвленням, т. Е. Без попередньої фіксації клітин.

Електронно-мікроскопічно показано, що зернисто-сітчасті структури являють собою залишки ендоплазматичноїмережі, рибосом і мітохондрій, що містять РНК. У ретикулоцитах в незначній мірі здійснюється синтез білка (глобіну), гема, пуринів, пірімідіннуклеотідов, фосфатидів, ліпідів, проте РНК в них не синтезується. Протягом 2 днів Ретикулоцит залишається в кровоносній руслі, після чого у міру зменшення РНК стає зрілим еритроцитом.

У мазках, пофарбованих звичайними гематологічними методами, ретикулоцити сірувато-рожевого кольору - поліхроматофільний, тобто пофарбовані різними барвниками.

Методи підрахунку ретикулоцитів

В даний час використовується уніфікований метод підрахунку кількості ретикулоцитів після забарвлення їх

діамантовим крезіловим синім,
азуром I або
азуром II безпосередньо на склі або в пробірці.

1. Принцип методу

Виявлення зернисто-сітчастої субстанції еритроцитів при фарбуванні лужними фарбами з подальшим підрахунком їх в мазку крові.

2. Реактиви:

а) насичений розчин діамантового крезілового синього в абсолютному спирті (для приготування абсолютного спирту треба витримати етанол 96% в декількох змінах прокаленного порошку мідного купоросу): 1,2 г фарби на 100 мл спирту;

б) розчин Азура I: АЗУР I - 1 г, амонію оксалат - 0,4 г, натрію хлорид - 0,8 г, спирт етиловий 96% - 10 мл, дистильована вода - 90 мл. Розчин фарби в закритому флаконі поміщають на 2-3 дня в тер- мостат при 37 ° С і періодично енергійно збовтують. Потім охолоджують до кімнатної температури і фільтрують через паперовий фільтр. Розчин зберігають в посуді з темного скла. При появі осаду фарбу слід знову профільтрувати;

в) розчин Азура II: АЗУР II - 1 г, натрію цитрат - 5 г, натрію хлорид - 0,4 г, дистильована вода - 45 мл. Розчин залишають в термостаті при 37 ° С на 2 діб, періодично помішуючи. Для прискорення розчинення фарбу можна прогріти на слабкому вогні протягом 15-20 хв, не доводячи до кипіння. Охолоджують до кімнатної температури і фільтрують. Зберігають в посуді з темного скла.

3. Забарвлення

добре вимите і знежирене предметне скло підігрівають над полум'ям пальника. Скляною паличкою наносять на скло краплю одного з барвників і готують мазок з фарби шліфованим склом. Маркують сторону скла, на яку нанесений мазок фарби, склографом. У такому вигляді скла можна заготовити про запас і зберігати в сухому темному місці;
на приготовані подібним чином скла наносять краплю крові, роблять тонкий мазок і зараз же поміщають скло у вологу камеру. Для цього використовують чашку Петрі з кришкою, в яку по краях вкладають злегка змочені валики марлі чи вати;
у вологій камері мазки витримують 3-5 хв, а потім висушують на повітрі. Зернисто-сітчаста субстанція ретикулоцитів забарвлюється у фіолетово-синій колір, чітко виділяючись на зеленувато-блакитному тлі еритроцитів.

метод 1: перед вживанням готують в пробірці робочий розчин діамантового крезілового синього з розрахунку на краплю 1% розчину оксалату калію 4 краплі розчину фарби 1. У фарбу додають 40 мкл крові (дві піпетки до позначки 0,02). Суміш ретельно, але обережно перемішують і залишають на 30 хв. Перемішують і готують тонкі мазки;
метод 2: в пробірку поміщають 0,05 мл розчину фарби 3 і 0,2 мл крові. Суміш ретельно перемішують і залишають на 20- 30 хв. Перемішують і готують тонкі мазки;
метод 3: в пробірку поміщають 0,3-0,5 мл розчину фарби 2 і 5-6 крапель крові піпеткою від апарату Панченкова. Пробірку закривають гумовою пробкою, суміш ретельно, але обережно перемішують і залишають на 1-1½ ч (краще фарбуються ретикулоцити при експозиції 1½ ч -3 ч). Перемішують і готують тонкі мазки.

4. Підрахунок ретикулоцитів

В мазках еритроцити пофарбовані в жовтувато-зеленуватий колір, зернисто-нитчатая субстанція - в синій або синювато-фіолетовий колір.

Приготовлені одним із зазначених вище способів мазки микроскопируют з іммерсійним об'єктивом;
необхідно підрахувати щонайменше 1000 еритроцитів і відзначити серед них кількість еритроцитів, що містять зернисто-нитчатую субстанцію. При рівномірних тонких мазках, в яких еритроцити розташовані в один ряд, підбирають таке поле зору, в якому є, наприклад, 50 еритроцитів, і потім прораховують 20 таких полів зору;
практично для більшої точності користуються спеціальним окуляром, в якому можна зменшити поле зору до необхідних розмірів. При відсутності готового окуляра його можна легко приготувати, для чого відгвинчують окуляр × 7, вкладають в нього шматок паперу з вирізаним невеликим квадратиком і загвинчують. Кількість підрахованих ретикулоцитів виражають на 1000 або на 100 еритроцитів.

Кількісний вміст ретикулоцитів

Підвищення кількості ретикулоцитів спостерігається при:

крововтратах (особливо гострої);
гемолітичних анеміях, особливо в період кризи (до 20-30%);
на тлі лікування мегалобластної анемії вітаміном В12 (ретіку- лоцітарний криз - підйом числаретикулоцитів на 4-8-й день лікування).

Зниження кількості ретикулоцитів характерно для:

апластична і гипопластических анемій;
нелеченной мегалобластноїанемії;
променевої хвороби;
прийому цитостатичних препаратів.

Суправітально метод забарвлення ретикулоцитів.

Виявлення зернисто-сітчастої субстанції ретикулоцитів при фарбуванні діамант-крезіловим синім без попередньої фіксації.

1% розчин діамант-крезілового синього: 50 мг фарби розчиняють в 5 мл фізіологічного розчину і додають 20 мг цитрату натрію (розчин зберігають в посуді з темного скла, придатний протягом декількох днів).

На предметне скло з лункою наносять 2 краплі 1% розчину фарби діамантового крезілового синього і 1 краплю крові. Обережно перемішують скляною паличкою і суміш поміщають у вологу камеру (чашку Петрі, в яку по краях вкладають злегка змочені валики марлі чи вати) на 30 хвилин при кімнатній температурі. Потім роблять мазки і висушують.

В мазках еритроцити фарбуються в жовтувато-зелений колір, а зернисто-сітчаста субстанція в ретикулоцитах - в синій і фіолетовий колір.

Мазки микроскопируют з іммерсійним об'єктивом. Підрахунок ретикулоцитів виробляють на 1000 еритроцитів (велика точність виходить при підрахунку еритроцитів).

Збільшення числа ретикулоцитівспостерігається при:

стимуляції еритропоезу (крововтрата, гемоліз, ретікулоцітарний криз при успішному лікуванні В12-дефіцитної анемії, гостра нестача кисню).

Зменшення числа ретикулоцитівспостерігається при:

пригніченні еритропоезу (апластичні і гіпопластичні анемії, нелікованих В 12-дефіцитної анемії, метастази раку в кістки),

захворюваннях нирок, ендокринних захворюваннях.

МЕТОДИ ПІДРАХУНКУ кількості ретикулоцитів

(1) Підрахунок кількості ретикулоцитів в мазку після забарвлення їх спеціальними барвниками. Даний метод є на практиці найбільш використовуваним методом в зв'язку з тим, що він простий, досить дешевий і не вимагає спеціального дорогого устаткування, відповідно може застосовуватися в будь-який клініко-діагностичної лабораторії. Принцип методу заснований на виявленні зернисто-сітчастої субстанції ретикулоцитів при суправітально забарвленні лужними фарбами (насичений розчин діамантового крезілового синього в абсолютному спирті / розчин Азура I / розчин Азура II) з подальшим підрахунком їх в мазку крові. Забарвлення ретикулоцитів проводять або на склі, або в пробірці. Підрахунок здійснюють за допомогою мікроскопа: приготовані одним із зазначених вище способів мазки микроскопируют з іммерсійним об'єктивом; в мазку ретикулоцити і еритроцити пофарбовані в жовтувато-зеленуватий колір, зернисто-нитчатая субстанція в ретикулоцитах - в синій (при фарбуванні азуром II і діамантовим крезіловим синім) або синювато-фіолетовий колір (при фарбуванні азуром I). (2) Підрахунок кількості ретикулоцитів за допомогою люмінесцентної мікроскопії. Даний метод відрізняється простотою і вимагає трохи часу, більш точний в порівнянні зі звичайним методом, так як при люмінесцентної мікроскопії виявляються дрібні зерна сетчато-нитчастих речовини, проте він можливий тільки при наявності люмінесцентного мікроскопа і спеціальних барвників, в зв'язку з чим доступний лише небагатьом лабораторіям . Принцип підрахунку кількості ретикулоцитів за допомогою люмінесцентної мікроскопії заснований на використанні здатності субстанції ретикулоцитів флюоресцировать після обробки крові акридиновим помаранчевим. Кров змішують з акридиновим помаранчевим в пробірці або змішувачі в співвідношенні 1 частина крові і 10 частин фарби (суміш можна зберігати не більше 5 годин). Суміш перемішують протягом 2 хвилин, краплю суміші наносять на предметне скло і накривають покривним склом. При цьому рідина не повинна виходити за межі покривного скла. Мікроскопують за допомогою світлофільтру ЖС-17. У препараті еритроцити мають темно-зелені обриси і не флюоресцируют, а в ретикулоцитах зернисто-сітчаста субстанція світиться яскраво-червоним кольором, завдяки чому ретикулоцити легко підрахувати. У крові, стабілізованої гепарином або цитратом натрію, флюоресценції ретикулоцитів не спостерігається. (3) Автоматичний підрахунок кількості ретикулоцитів за допомогою гематологічного аналізатора. В сучасних гематологічних аналізаторах технологія підрахунку формених елементів крові заснована на кондуктометричну методі, запропонованому H. Wallace і Joseph R. Culter в 1947 р Принцип методу полягає в підрахунку числа і визначенні характеру імпульсів, що виникають при проходженні клітини через отвір малого діаметру (апертуру), по обидва боки якого розташовані два ізольованих один від одного електрода. Кожне проходження клітини через апертуру супроводжується появою електричного імпульсу, який реєструється електронним датчиком. Поділ клітин за категоріями (еритроцити, лейкоцити, тромбоцити, осад) здійснюється приладом на підставі аналізу амплітуди отриманих імпульсов.Чтоби визначити концентрацію клітин, досить пропустити певний обсяг проби через канал і підрахувати кількість імпульсів, що при цьому генеруються. Слід звернути увагу на те, що крім класичного параметра ретикулоцитів - відносне (%) вміст ретикулоцитів (RET%, percent of reticulocytes), що визначається за допомогою 1 і 2 методів лабораторної діагностики, в зв'язку з появою високотехнологічних гематологічних аналізаторів (3 метод) стало можливим отримувати (наприклад, за допомогою запатентованого флюоресцентного барвника для аналізатора Sysmex -XT- 2000i) додаткові інформативні ретикулоцитарного параметри: ретикулоцити з низьким вмістом РНК, найбільш зрілі (LFR%, low fluorescence reticulocyte fractions, фракція ретикулоцитів з низькою флуоресценцией); ретикулоцити із середнім вмістом РНК (MFR%, medium fluorescence reticulocyte fractions) - фракція ретикулоцитів із середньою флуоресценцией); ретикулоцити з високим вмістом РНК (HFR%, high fluorescence reticulocyte fractions) - фракція ретикулоцитів з високою флуоресценцией); незріла фракція ретикулоцитів (IRF%, Immature Reticulocyte Fraction). Диференціація ретикулоцитів, заснована на ступені зрілості і, відповідно, зміст нуклеїнових кислот, є відображенням гемопоетичних активності кісткового мозку. Методика (аналізатор Sysmex -XT- 2000i). У проточній кюветі клітини перетинають промінь напівпровідникового лазера, при цьому відбувається розсіювання променя під великим і малим кутами і збудження флюоресцентного барвника. Це дозволяє визначати різні стадії зрілості ретикулоцитів за змістом РНК в клітинах і інтенсивності їх світіння. Автоматизований підрахунок ретикулоцитів відрізняється високою точністю (підраховується болееерітроцітов) і відтворюваністю (коефіцієнт варіації становить близько 6%). Дана технологія забезпечує точний підрахунок ретикулоцитів навіть при їх гранично низьких концентраціях.

Ретикулоцитопенії і ретикулоцитоз, причини розвитку, діагностичне значення їх виявлення.

Метод підрахунку кількості ретикулоцитів після забарвлення їх діамантовим крез муловим синім, азуром I або азуром II безпосередньо на склі або в пробірці

Принцип. Суправітально забарвлення барвниками, які виявляють зерністо- нитчатую субстанцію ретикулоцитів.

Реактиви. Можна використовувати один з наступних барвників.

1. Насичений розчин діамантового крезілового Синега про в абсолютному спирті (для приготування абсолютного спирту треба витримати етанол 96% в декількох змінах прокаленного порішкл мідного купоросу).

2. Розчин Азура I, запропонований П. Н. Корікова: АЗУР I - 1 г, амонію оксалат - 0,4 г, натрію хлорид - 0,8 г, спирт етиловий 96% -10 мл, дистильована вода - 90 мл. Розчин фарби в закритому флаконі поміщають на 2-3 дня в термостат при 37 ° С і періодично енер | ічно збовтують. Потім охолоджують до кімнатної температури і фільтрують через паперовий фільтр. Розчин зберігають в посуді з темного скла. При появі осаду фарбу слід знову профільтрувати.

3. Розчин Азура II наступного складу: АЗУР II - 1 г, натрію цитрат - 5 г натрію хлорид - 0,4 г, дистильована вода - 45 мл. Розчин залишають в термос таті при 37 ° С на 2 діб, періодично помішуючи. Для прискорення розчинення фарбу можна прогріти на слабкому вогні в теченіемін, не доводячи до кипіння. Охолоджують до кімнатної температури і фільтрують. Зберігають в посуді з темного скла.

Спеціальне обладнання. Мікроскоп.

Хід визначення. Про 1 \\ ра ^ 1 \\ ї пі с.ек /. Е. Добре вимите і знежирене предметне скло підігрівають над полум'ям пальника. Скляною паличкою наносять на скло краплю одного з барвників і готують мазок з фарби шліфованим склом. Маркують сторону скла, на яку нанесений мазок фарби, склографом. У такому вигляді скла можна заготовити про запас і зберігати в сухому темному місці. Наносять краплю крові на Ьшоог. I ідо вьт з Пеї

тонкий мазок і негайно поміщають у вологу камеру на 3 4 хв (можна поль тися чашкою Петрі з укладеними по краях валиками змоченою вати або фільтрувального паперу). Потім висушують мазки на повітрі.

Забарвлення в пробірці. Метод /: перед вживанням готують в пробірці робочий розчин діамантового крезілового синього з розрахунку на краплю 1% розчину оксалату калію 4 краплі розчину фарби 1. У фарбою) додають 0.04 мл крові (дві піпетки до позначки 0,02). Суміш ретельно, але обережно перемішують і залишають на 30 хв Перемішують і готують тонкі мазки.

Метод 2: в пробірку поміщають 0,05 мл розчину фарби 3 у 0,2 мл крові. Суміш ретельно перемішують і залишають Намин. Перемішують і готують тонкі мазки.

Метод 3: в пробірку поміщають 0,3-0,5 мл розчину фарби 2 і 5-6 крапель крові піпеткою від апарату Панченкова. Пробірку закривають гумовою пробкою, суміш ретельно, але обережно перемішують і залишають на 1,5 год (краще фарбуються ретикулоцити при експозиції 1 / 2-3 ч). Перемішують і готують тонкі мазки.

Підрахунок ретикулоцитів. В мазках еритроцити пофарбовані в желтоватозеленоватую колір, зернисто-нитчатая субстанція - в синій або синьо го-фіо- Лєтова колір.

Приготовлені одним із зазначених вище способів мазки мікроскопіру- ють з іммср1\u003e шл1ним об'єктивом. Нсобхідімі підрахувати щонайменше 1000 еритроцитів і відзначити серед них кількість еритроцитів, що містять зерністонітчатую субстанцію. Практично для більшої точності користуються спеціальним окуляром, в якому можна зменшити поле зору до необхідних розмірів. При рівномірних тонких мазках, в яких еритроцити розташовані в один ряд, підбирають таке поле зору, е якому є, наприклад, 50 еритроцитів, і потім прораховують 20 таких полів зору. При відсутності готового окуляра його можна легко приготувати, для чого відгвинчують окуляр 7х, вкладають в нього шматок паперу з вирізаним невеликим квадратиком і загвинчують. Кількість підрахованих ретікулоцітор висловлюють на * 1000 або на 100 еритроцит ів.

ретикулоцити

Ретікулоціти- молоді еритроцити, що утворюються після втрати нормобластов ядер. Характерною особливістю ретикулоцитів є наявність в цитоплазмі зернисто-нитчатой \u200b\u200bсубстанції, що представляє агреговані рибосоми і мітохондрії. Ця субстанція виявляється при спеціальному методі забарвлення - суправітально (прижиттєва), т. Е. Без попередньої фіксації клітин. Зернисто-нитчатая субстанція в різних ретикулоцитах відрізняється поліморфізмом; ніж клітина молодше, тим субстанція більш рясна. У наймолодших ретикулоцитів вона має форму густого клубка, у більш зрілих клітин виявляється у вигляді сіточки, окремих ниток і потім окремих зерен. У мазках, пофарбованих звичайними гематологічними методами, ретикулоцити сірувато-рожевого кольору - поліхроматофільний, т. Е. Пофарбовані різними барвниками.

Визначення кількості ретикулоцитів проводиться при мікроскопії спеціально забарвлених мазків

3.2.1 Методика забарвлення мазків крові на ретикулоцити по Алексєєву (підрахунок по фоніо)

Принцип: Метод заснований на підрахунку числа ретикулоцитів в забарвлених мазках крові на 1000 еритроцитів. Готують одночасно 2 мазка (на тромбоцити і ретикулоцити).

Реактив: робочий розчин фарби по Алексєєву

Хід визначення: У капіляр для визначення ШОЕ набирають робочий розчин до мітки 0,75 мкл, і повний капіляр крові з проколу пальця хворого. Співвідношення барвника до крові становить 1: 4. Суміш залишають на 2 години, потім роблять тонкий мазок на предметному склі. Мазок висушують на повітрі і проводять мікроскопію з иммерсией.

Підрахунок проводять таким чином: сітки ретикулоцитів фарбуються в синій колір. Під час підрахунку еритроцитів в полі зору вважають кількість ретикулоцитів. Підраховують 1000 еритроцитів. Результат виражають у відсотках.

Нормативна величина: У крові здорової людини міститься 0,2-1,0%

(Або 2-10 навіть допускається до 12 промміль) ретикулоцитів

Клініко-діагностичне значення: Поява ретикулоцитів в периферичної крові вказує на посилену роботу кісткового мозку і використовується при оцінці різних видів анемій.

Підвищення кількості ретикулоцитів спостерігається після крововтрати, при гемолітичних анеміях

Різкий ретикулоцитоз - наголошується при гемолітичній жовтяниці

Зниження кількості ретикулоцитів при наявності анемії говорить про апластична типі кровотворення.

За рівнем ретикулоцитів в крові анемії поділяються на:

Регенераторні (кількість ретикулоцитів 0,5-5% - це постгеморрагические анемії);

Гіперрегенераторним (кількість ретикулоцитів більше 5% - це гемолітичні анемії);

Гіпо - і арегенераторние (кількість ретикулоцитів знижено або вони відсутні, незважаючи на важкий перебіг анеміі- гіпо - і апластичні, залізо і. У 12- дефіцитні анемії).

1.) Підрахунок кількості ретикулоцитів в мазку після забарвлення їх спеціальними барвниками.

Даний метод є на практиці найбільш використовуваним методом в зв'язку з тим, що він простий, досить дешевий і не вимагає спеціального дорогого устаткування, відповідно може застосовуватися в будь-який клініко-діагностичної лабораторії.

Принцип методу заснований на виявленні зернисто-сітчастої субстанції ретикулоцитів при суправітально забарвленні лужними фарбами (насичений розчин діамантового крезілового синього в абсолютному спирті / розчин Азура I / розчин Азура II) з подальшим підрахунком їх в мазку крові. Забарвлення ретикулоцитів проводять або на склі, або в пробірці. Підрахунок здійснюють за допомогою мікроскопа: приготовані одним із зазначених вище способів мазки микроскопируют з іммерсійним об'єктивом; в мазку ретикулоцити і еритроцити пофарбовані в жовтувато-зеленуватий колір, зернисто-нитчатая субстанція в ретикулоцитах - в синій (при фарбуванні азуром II і діамантовим крезіловим синім) або синювато-фіолетовий колір (при фарбуванні азуром I).

2.) Підрахунок кількості ретикулоцитів за допомогою люмінесцентної мікроскопії.

Даний метод відрізняється простотою і вимагає трохи часу, більш точний в порівнянні зі звичайним методом, так як при люмінесцентної мікроскопії виявляються дрібні зерна сетчато-нитчастих речовини, проте він можливий тільки при наявності люмінесцентного мікроскопа і спеціальних барвників, в зв'язку з чим доступний лише небагатьом лабораторіям .

Принцип підрахунку кількості ретикулоцитів за допомогою люмінесцентної мікроскопії заснований на використанні здатності субстанції ретикулоцитів флюоресцировать після обробки крові акридиновим помаранчевим. Кров змішують з акридиновим помаранчевим в пробірці або змішувачі в співвідношенні 1 частина крові і 10 частин фарби (суміш можна зберігати не більше 5 годин). Суміш перемішують протягом 2 хвилин, краплю суміші наносять на предметне скло і накривають покривним склом. При цьому рідина не повинна виходити за межі покривного скла.

3.) Автоматичний підрахунок кількості ретикулоцитів за допомогою гематологічного аналізатора.

В сучасних гематологічних аналізаторах технологія підрахунку формених елементів крові заснована на кондуктометричну методі, запропонованому H. Wallace і Joseph R. Culter в 1947 р Принцип методу полягає в підрахунку числа і визначенні характеру імпульсів, що виникають при проходженні клітини через отвір малого діаметру (апертуру), по обидва боки якого розташовані два ізольованих один від одного електрода. Кожне проходження клітини через апертуру супроводжується появою електричного імпульсу, який реєструється електронним датчиком. Поділ клітин за категоріями (еритроцити, лейкоцити, тромбоцити, осад) здійснюється приладом на підставі аналізу амплітуди отриманих імпульсов.Чтоби визначити концентрацію клітин, досить пропустити певний обсяг проби через канал і підрахувати кількість імпульсів, що при цьому генеруються.

Слід звернути увагу на те, що крім класичного параметра ретикулоцитів - відносне (%) вміст ретикулоцитів (RET%, percent of reticulocytes), що визначається за допомогою 1 і 2 методів лабораторної діагностики, в зв'язку з появою високотехнологічних гематологічних аналізаторів (3 метод) стало можливим отримувати (наприклад, за допомогою запатентованого флюоресцентного барвника для аналізатора Sysmex -XT- 2000i) додаткові інформативні ретикулоцитарного параметри:
ретикулоцити з низьким вмістом РНК, найбільш зрілі (LFR%, low fluorescence reticulocyte fractions, фракція ретикулоцитів з низькою флуоресценцией);
ретикулоцити із середнім вмістом РНК (MFR%, medium fluorescence reticulocyte fractions) - фракція ретикулоцитів із середньою флуоресценцией);
ретикулоцити з високим вмістом РНК (HFR%, high fluorescence reticulocyte fractions) - фракція ретикулоцитів з високою флуоресценцией);
незріла фракція ретикулоцитів (IRF%, Immature Reticulocyte Fraction).

Методика (аналізатор Sysmex -XT- 2000i). У проточній кюветі клітини перетинають промінь напівпровідникового лазера, при цьому відбувається розсіювання променя під великим і малим кутами і збудження флюоресцентного барвника. Це дозволяє визначати різні стадії зрілості ретикулоцитів за змістом РНК в клітинах і інтенсивності їх світіння. Автоматизований підрахунок ретикулоцитів відрізняється високою точністю (підраховується більше 30 000 еритроцитів) і відтворюваністю (коефіцієнт варіації становить близько 6%). Дана технологія забезпечує точний підрахунок ретикулоцитів навіть при їх гранично низьких концентраціях.

\u003e Підрахунок ретикулоцитів

Дана інформація не може використовуватися при самолікуванні!
Обов'язково необхідна консультація з фахівцем!

Для чого потрібен підрахунок ретикулоцитів?

Підрахунок ретикулоцитів - це лабораторне дослідження крові, яке дозволяє оцінити ефективність еритропоезу. Еритропоезу називається процес утворення еритроцитів в кістковому мозку. А ретикулоцити - це клітини крові, які є перехідною формою між попередниками червоних кров'яних тілець, що утворюються в кістковому мозку, і еритроцитами, які циркулюють в кров'яному руслі. Їх кількість показує, наскільки інтенсивно відбувається процес кровотворення.

В яких випадках проводять підрахунок еритроцитів?

Необхідність в підрахунку ретикулоцитів виникає, коли в клінічному аналізі крові виявляються ознаки анемії або порушення еритропоезу: зниження або підвищення кількості еритроцитів або концентрації гемоглобіну, поява еритроцитів ненормальних розмірів або форми та ін. Дослідження допомагає діагностувати вид анемії і контролювати процес її лікування. Підрахунок ретикулоцитів також проводиться для моніторингу ефективності хіміо- і променевої терапії при пухлинах кісткового мозку.

Хто може призначити аналіз і де його можна зробити?

Аналіз може призначити терапевт, педіатр, гематолог, інфекціоніст, хірург або гінеколог. Його роблять в державних поліклініках і приватних медичних центрах, які здійснюють забір крові для лабораторного дослідження. Для підрахунку ретикулоцитів беруть кров з пальця або з вени і досліджують її під мікроскопом або за допомогою гематологічного аналізатора. Результат аналізу буває готовий на наступний день.

Як підготуватися до дослідження?

На результат аналізу можуть вплинути деякі нестероїдні протизапальні засоби, антибіотики групи фторхинолонового і тетрациклінового ряду, похідні нітрофурану, транквілізатори, тиреостатики і інші лікарські засоби. Тому за добу до дослідження бажано припинити прийом ліків, попередньо погодивши їх одноденну скасування з лікарем. За 2-3 години до забору крові бажано не їсти і не курити. Можна пити чисту воду без газу.

Яка кількість ретикулоцитів вважається нормальним?

В абсолютних значеннях число ретикулоцитів у жінок має бути 17-63,8 х 10 ^ 9 / л, у чоловіків воно варіює від 23 до 70 х 10 ^ 9 / л. У відсотковому відношенні ретикулоцити становлять від 0,5 до 1,9% від загального числа еритроцитів. Найбільша кількість незрілих еритроцитів відзначається у новонароджених дітей (за різними даними від 5 до 15%). З віком їх кількість поступово зменшується. Збільшення числа ретикулоцитів відзначається у вагітних, курців і альпіністів.

Про які захворювання можуть говорити відхилення від норми?

Підвищення кількості ретикулоцитів називається ретікулоцитозом, зниження - ретикулоцитопенією. Сам по собі рівень ретикулоцитів не є підставою для постановки будь-якого діагнозу, але дозволяє лікарю більш вірно припустити, який патологічний процес відбувається в організмі.

Зменшення числа ретикулоцитів або навіть повна їх відсутність спостерігається при різних видах анемії (гипопластической, апластичної, сидеробластної, спричиненої нестачею заліза, фолієвої кислоти, вітаміну B12), при метастазах пухлини в кістку, при лікуванні цитостатиками, променевої хвороби і променевої терапії.

Причинами ретикулоцитоза можуть бути гемолітична анемія (в цьому випадку число ретикулоцитів досягає 60 і більше відсотків), гостра крововтрата (на 3-4 добу після неї виникає ретікулоцітарний криз), малярія, поліцитемія, антианемічна лікування, гострий брак кисню. Підвищена кількість ретикулоцитів може свідчити про прихований кровотечі (наприклад, у людей з виразковою хворобою).

Підрахунок ретикулоцитів в мазку після забарвлення їх спеціальними барвниками

Можна використовувати один з наступних барвників: Розчин Азура I; Розчин Азура II;

Хід визначення: Забарвлення проводять або на склі, або в пробірці.

Забарвлення ретикулоцитів в пробірці азуром II

Забарвлення ретикулоцитів в пробірці азуром I

Ретикулоцити є важливим показником регенераторной здатності кісткового мозку. Збільшення їх в периферичної крові (ретикулоцитоз) відзначається при гемолітичних анеміях, при гемолітичних кризах, при гострих крововтратах, малярії, при лікуванні залізом залізодефіцитних анемій, при гострій нестачі кисню. Наявність підвищеної кількості ретикулоцитів дозволяє запідозрити приховане кровотеча (наприклад, у хворих на черевний тиф, виразкову хворобу).

Техніка проведення проби Рівальта.

Проба Рівальта - біохімічний тест для диференціюванні транссудата і ексудату.

… визначення числа ретикулоцитів є важливим показником функції кісткового мозку.

ретикулоцити - це молоді форми еритроцитів, що утворилися з нормобластов після втрати ними ядра (без'ядерні, незрілі еритроцити), дозрівання яких відбувається протягом 24-48 годин після виходу в периферичну кров з кісткового мозку, і що відображають регенеративную здатність кісткового мозку (тобто ерітропоетіческую активність кісткового мозку).

МОРФОЛОГІЯ І КЛІНІЧНЕ ЗНАЧЕННЯ ретикулоцитів

Ретикулоцити звичайно крупніше, ніж зрілі еритроцити. Цитоплазма ретикулоцитів містить базофильную сіточку (ретикулум) у вигляді дрібних зерен, окремих ниток, клубочків і т.п., яка представляє собою агреговані рибосоми і мітохондрії.

За ступенем зрілості розрізняють 5 видів ретикулоцитів:
(1) ретикулоцити, що мають ядро \u200b\u200b(ерітронормобластов), причому зернистість у них розташовується у вигляді щільного віночка навколо ядра;
(2) ретикулоцити, що мають зернисто-сітчасту субстанцію у вигляді клубка або грудочки;
(3) ретикулоцити, що мають зернистість у вигляді густої мережі;
(4) ретикулоцитів, мають зернисто-сітчасту субстанцію у вигляді окремих ниток;
(5) ретикулоцити, що містять окремі зернятка.

Запам'ятайте: В нормі, за Г. А. Алексєєву, майже 80% ретикулоцитів відноситься до IV - V груп.

У нормі в периферичної крові міститься 0,2 - 1% ретикулоцитів ( «%» - вміст ретикулоцитів від загального числа еритроцитів). Даний показник відображає можливість виходу ретикулоцитів в периферичну кров і їх подальше перетворення в зрілі еритроцити (дозрівання), як варіант норми, вже в периферичної крові (протягом декількох годин). ( ! ) При нормальному еритропоезі більшість еритроцитів проходить стадію ретикулоцитів в кістковому мозку.

Збільшення ретикулоцитів їх в периферичної крові (ретикулоцитоз) відзначається:
при гемолітичних анеміях (число ретикулоцитів може доходити до 60% і більше (особливо сильно збільшуючись при гемолітичних кризах);
при гострих крововтратах (на 3 - 5 добу після крововтрати виникає ретікулоцітарний криз), в тому числі, збільшення ретикулоцитів дозволяє запідозрити приховане кровотеча (наприклад, у хворих на виразкову хворобу шлунково-кишкового тракту, Черевним тифом);
при малярії;
при поліцитемії;
при лікуванні залізом залізодефіцитних анемій (через кілька днів (3 - 10) після початку антианемического лікування перніциозної анемії);
при гострій нестачі кисню;
при метастазах пухлин в кістковий мозок.

слід пам'ятати, Що в разі посиленого руйнування еритроцитів частка ретикулоцитів може перевищувати 50% внаслідок штучного завищення числаретикулоцитів (як уже було зазначено раніше, частка ретикулоцитів розраховується в% від всіх еритроцитів). У таких випадках ля оцінки тяжкості анемій використовують «ретикулярний індекс», який розраховують за формулою: (% ретикулоцитів х гематокрит) / 45 х 1,85, де 45 - нормальний гематокрит, 1,85- кількість діб, необхідних для вступу нових ретикулоцитів в кров. якщо індекс< 2 – говорит о гипопролиферативном компоненте анемии, если > 2-3, то відбувається збільшення утворення еритроцитів.

істинний ретикулоцитоз: Збільшення кількості ретикулоцитів в периферичної крові з одночасним збільшенням кількості ретикулоцитів в кістковому мозку.

помилковий ретикулоцитоз: Відсутність підвищеної кількості ретикулоцитів в кістковому мозку при підвищенні їх кількості в периферичної крові (що говорить про посилення вимивання ретикулоцитів з кісткового мозку в периферичну кров).

Фактором, що призводить до збільшення значення% -ого вмісту ретикулоцитів можуть бути прийом таких препаратів: кортикотропін, протималярійні лікарські засоби, Жарознижуючі препарати, фуразолидона (у маленьких дітей), леводопи.

Запам'ятайте: Ретикулоцитоз, без відповідної ерітронормобластіческой реакції кісткового мозку, спостерігається при подразненні окремих ділянок його раковими метастазами або запальними вогнищами.

Зниження кількості або відсутність ретикулоцитів (ретикулоцитопенія) спостерігається:
при арегенераторних апластических і гипопластических анеміях;
при анеміях, викликаних недостатністю вмісту заліза, вітаміну B12, фолієвої кислоти (мікроцітарная-гіпохромні і мегалобластні анемії);
при таласемії;
при сидеробластної анемії;
при метастазах раку в кістку;
при променевої хвороби і променевої терапії;
при лікуванні цитостатиками;
при аутоімунних захворюваннях системи кровотворення;
при захворюваннях нирок;
при алкоголізмі;
при рецидиві анемії Аддісона-Бірмера;
при мікседемі.

Фактори, що спотворюють результат лабораторного дослідження% -ого вмісту ретикулоцитів:
неправильний вибір антикоагулянту або недостатнє перемішування крові з антикоагулянтом;
тривале здавлювання руки джгутом;
прийом сульфаніламідів (можливі як занижені, так і завищені результати);
переливання крові незадовго до дослідження;
гемоліз проби крові.

Показання до призначення аналізу на ретикулоцити:
оцінка активності еритропоезу при станах, що супроводжуються гемолізом або крововтратою;
ценка здатності кісткового мозку до регенерації після цитотоксичної терапії та трансплантації кісткового мозку;
ценка відновлення синтезу еритропоетину після трансплантації нирки;
допінговий контроль у спортсменів (прийом еритропоетину);
діагностика неефективного гемопоезу або зниження продукції еритроцитів;
диференціальна діагностика анемій;
детекція порушення регенераторной здатності кісткового мозку при дефіциті заліза, вітамінів B12, B6, фолатів, міді і моніторингу відповідної терапії;
оцінка реакції на терапію еритропоетином, ерітросупрессорамі.

МЕТОДИ ПІДРАХУНКУ кількості ретикулоцитів

(1) Підрахунок кількості ретикулоцитів в мазку після забарвлення їх спеціальними барвниками.

(2) Підрахунок кількості ретикулоцитів за допомогою люмінесцентної мікроскопії.

(3) Автоматичний підрахунок кількості ретикулоцитів за допомогою гематологічного аналізатора.

В сучасних гематологічних аналізаторах технологія підрахунку формених елементів крові заснована на кондуктометричну методі, запропонованому H. Wallace і Joseph R. Culter в 1947 р Принцип методу полягає в підрахунку числа і визначенні характеру імпульсів, що виникають при проходженні клітини через отвір малого діаметру (апертуру), по обидва боки якого розташовані два ізольованих один від одного електрода. Кожне проходження клітини через апертуру супроводжується появою електричного імпульсу, який реєструється електронним датчиком. Поділ клітин за категоріями (еритроцити, лейкоцити, тромбоцити, осад) здійснюється приладом на підставі аналізу амплітуди отриманих імпульсов.Чтоби визначити концентрацію клітин, досить пропустити певний обсяг проби через канал і підрахувати кількість імпульсів, що при цьому генеруються.

Слід звернути увагу на те, що крім класичного параметра ретикулоцитів - відносне (%) вміст ретикулоцитів (RET%, percent of reticulocytes), що визначається за допомогою 1 і 2 методів лабораторної діагностики, в зв'язку з появою високотехнологічних гематологічних аналізаторів (3 метод) стало можливим отримувати (наприклад, за допомогою запатентованого флюоресцентного барвника для аналізатора Sysmex -XT- 2000i) додаткові інформативні ретикулоцитарного параметри:
ретикулоцити з низьким вмістом РНК, Найбільш зрілі (LFR%, low fluorescence reticulocyte fractions, фракція ретикулоцитів з низькою флуоресценцией);
ретикулоцити із середнім вмістом РНК(MFR%, medium fluorescence reticulocyte fractions) - фракція ретикулоцитів із середньою флуоресценцией);
ретикулоцити з високим вмістом РНК(HFR%, high fluorescence reticulocyte fractions) - фракція ретикулоцитів з високою флуоресценцией);
незріла фракція ретикулоцитів(IRF%, Immature Reticulocyte Fraction).

Методика (аналізатор Sysmex -XT- 2000i). У проточній кюветі клітини перетинають промінь напівпровідникового лазера, при цьому відбувається розсіювання променя під великим і малим кутами і збудження флюоресцентного барвника. Це дозволяє визначати різні стадії зрілості ретикулоцитів за змістом РНК в клітинах і інтенсивності їх світіння. Автоматизований підрахунок ретикулоцитів відрізняється високою точністю (підраховується більше 30 000 еритроцитів) і відтворюваністю (коефіцієнт варіації становить близько 6%). Дана технологія забезпечує точний підрахунок ретикулоцитів навіть при їх гранично низьких концентраціях.